PCR komplet za virus majmunskih boginja u realnom vremenu

1. Uzorakkolekcija:Uzorak treba prikupiti u sterilne epruvete u skladu sa tim

sa standardnim tehničkim specifikacijama.

2. Priprema reagensa (područje za pripremu reagensa)

Izvadite komponente kompleta, izbalansirajte ih na sobnoj temperaturi za upotrebu u stanju pripravnosti.

3. Obrada uzoraka (područje obrade uzoraka)

3.1 Ekstrakcija nukleinske kiseline

Preporučuje se uzimanje 200μL tečnih uzoraka, pozitivne kontrole i negativne kontrole za ekstrakciju nukleinske kiseline, prema odgovarajućim zahtjevima i procedurama kompleta za ekstrakciju virusne DNK.

3.2 Otapanje liofiliziranog praha i dodavanje šablona

Pripremite liofilizirani premiks virusa majmunskih boginja prema broju uzoraka.Za jedan uzorak potrebna je jedna PCR epruveta koja sadrži liofilizirani premiks prah.Negativnu kontrolu i pozitivnu kontrolu treba tretirati kao dva uzorka.

(1) Dodajte 15 μL rastvora za otapanje u svaku PCR epruvetu koja sadrži liofilizovani premiks, zatim dodajte 5 μL ekstrahovanih uzoraka/negativne kontrole/pozitivne kontrole u svaku PCR epruvetu.

(2) Čvrsto pokrijte PCR epruvete, ručno protresite PCR epruvete dok se liofilizirani prah potpuno ne otopi i pomiješa, sakupite tekućinu na dno PCR epruveta trenutnim centrifugiranjem pri maloj brzini.

(3) Ako koristite uobičajeni PCR instrument u realnom vremenu za detekciju, onda direktno prenesite PCR epruvete u područje amplifikacije;ako koristite BTK-8 za detekciju, potrebno je izvršiti sljedeće operacije: prenijeti 10 μL tečnosti iz PCR epruvete u reakcioni čip bunar BTK-8.Jedna PCR epruveta odgovara jednoj jažici na čipu.Tokom operacije pipetiranja, vodite računa da je pipeta vertikalno postavljena pod uglom od 90 stepeni.Vrhove pipete sa aerosolnom barijerom treba postaviti u središte otvora sa umjerenom silom i prestati gurati pipetu kada dostigne prvu brzinu (da bi se izbjegli mjehurići).Nakon što se jažice popune, izvadite membranu reakcionog čipa da pokrijete sve jažice i čip se zatim prenosi u područje detekcije pojačanja.

4. PCR amplifikacija (područje detekcije)

4.1 Stavite PCR epruvete/reakcioni čip u reakcioni rezervoar i postavite nazive svake reakcione jažice odgovarajućim redosledom.

4.2 Postavke detekcije fluorescencije: (1) virus majmunskih boginja (FAM);(2) Interna kontrola (CY5).

4.3 Pokrenite sljedeći protokol ciklusa

Protokol ABI7500, Bio-Rad CFX96, SLAN-96S, QuantStudio:

 Protokol BTK-8:

5. Analiza rezultata (molimo pogledajte Uputstvo za upotrebu instrumenta)

Nakon reakcije, rezultati će se automatski pohraniti.Kliknite na “Analyze” za analizu i instrument će automatski interpretirati Ct vrijednosti svakog uzorka u koloni rezultata.Negativni i pozitivni rezultati kontrole moraju biti u skladu sa sljedećim "6. Kontrola kvaliteta".

6. Kontrola kvaliteta

6.1 Negativna kontrola: Nema Ct ili Ct>40 u FAM kanalu, Ct≤40 u CY5 kanalu sa normalnom krivom pojačanja.

6.2 Pozitivna kontrola: Ct≤35 u FAM kanalu sa normalnom krivom pojačanja, Ct≤40 u CY5 kanalu sa normalnom krivom pojačanja.

6.3 Rezultat je validan ako su ispunjeni svi gore navedeni kriterijumi.U suprotnom, rezultat je nevažeći.

Interpretacija rezultata

Mogući su sljedeći rezultati:

BILJEŠKA: Ako dođe do nevažećeg rezultata, uzorak treba uzeti i ponovo testirati.